產品描述

《Quick Cell探針法支原體檢測試劑盒》（Quick Cell qPCR Mycoplasma Detection Kit with Probe）采用支原體特異性引物和支原體特異性熒光探針（報告基因為FAM），用于對樣品的支原體基因組DNA進行熒光定量PCR擴增檢測。試劑盒內同時含有內參對照質粒mycoIC2和相應的引物和熒光探針（報告基因為VIC），用于監控支原體DNA提取和qPCR擴增的效率。本試劑盒可用于檢測一切可能含支原體的樣品，比如：體外細胞培養的上清、血清、各種體液（如唾液、尿液、鼻腔分泌物）、別的液體樣品。
經多次測試，本試劑盒有記錄可以識別在體外細胞培養中曾經報道出現的20種支原體。根據文獻報道，這些支原體基本上占污染細胞的支原體種類的100%。具體如下：（1）M. hyorhinis、（2）M. fermentans、（3）M. arginini、（4）M. hominis、（5）M. orale、（6）M. salivarium、（7）M.pirum、（8）A. laidlawii、（9）M. agalactiae、（10）M. bovis、(11) M. bovoculi、（12）A. axanthum、（13）M. buccale、 (14) M. pneumoniae、（15）M. arthritidis、（16）M. pulmonis、（17）M. gallisepticum、（18）M. gallinarum、（19）M. canis、（20）Ureaplasma urealyticum（注：M.為Mycoplasma的縮寫；A.為Acholeplasma的縮寫）。

訂購信息

產品組分

【注】：①本試劑盒由于含有內參質粒mycoIC2（用于監控支原體DNA提取和qPCR擴增的有效性），客戶可以選擇進行樣品支原體DNA的提?。▋葏①|粒mycoIC2在支原體DNA提取過程中加入），也可以選擇不進行樣品支原體DNA的提?。▋葏①|粒mycoIC2直接加入樣品中）。
②本試劑盒的配套儀器可以是任何具有FAM和VIC檢測通道的熒光定量PCR儀。
運輸與保存
藍冰運輸。-20℃避光保存，有效期60個月。
使用方法
1.待測樣品的準備
為了準確判斷細胞是否有支原體的污染，待測的細胞培養液樣品需要取自換液后培養2-3 d 且匯合度在90%左右的細胞培養液上清（貼壁細胞）。懸浮培養的細胞也需要在換液傳代后，讓細胞生長2-3 d 再取培養液進行檢測?？梢园凑找韵聝煞N方法之一進行樣品的前處理：
方法一：對樣品進行支原體DNA的提取
（1）很多樣品（比如：培養很多天的細胞上清、血清、血漿等）由于含有抑制PCR擴增的成分，如果樣品不進行前處理而直接檢測，有可能導致qPCR擴增失?。╭PCR結果：支原體通道和內參對照通道均無擴增曲線）。該類樣品建議客戶進行樣品DNA提?。ɑ蛘唠x心清洗，見后文方法二）后，再進行檢測。提取DNA的過程有兩個作用：①可以*去除所有可能抑制PCR擴增的成分，保證后續定量PCR擴增的正常進行；②具有濃縮支原體DNA的作用，可以提高相對檢測靈敏度10-100倍。
方法二：樣品不經DNA提取（推薦本方法，不僅可以濃縮支原體從而提高相對檢測靈敏度，還可以去除絕大部分可能的抑制物，PCR擴增被抑制的可能性極低）
（1）根據濃縮倍數，可以取100 - 1500 μL上述待測樣品到1.5 mL離心管內，在普通臺式離心機上1000 rpm (大約150 g)低速離心5 min，將離心后的上清轉移到另一個離心管內，丟棄細胞沉淀。
（2）將上清繼續13000 rpm（約16000 g）高速離心5 min，小心吸走全部上清（勿碰到沉淀?。?，用50μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8（樣品可長期保存）重懸沉淀（沉淀中含有支原體），吹吸均勻（如果最初使用了1500 μL的樣品，則支原體濃度大約提高了30倍）。
（3）往50 μL重懸后的樣品中加入4 μL內參質粒mycoIC2（內參質粒融化后，請混勻后再吸?。?。
（4）進行熱處理后再檢測,具體如下：95 ℃加熱處理5 min（可以轉移到PCR管內，在PCR儀上進行加熱處理），簡單離心（1000 g，5 s）后，取上清進行檢測。
【注】：①這里的細胞培養上清不是指細胞經胰酶消化后的離心上清，而是指至少培養2 d 后的貼壁細胞培養液上清（不需要胰酶消化，也不能取經胰酶消化后的離心上清進行檢測）或懸浮細胞培養液。
②本步驟的低速離心,需要嚴格控制在150-200 g，該離心力下哺乳動物細胞將被沉淀下來而支原體不會；否則，容易導致假陰性。
③收集的待測細胞培養液樣品如果不立即檢測，請放于-20℃或-80℃冰箱保存；為了節約檢測成本，可以將不同時間收集的樣品放于-20℃或-80℃冰箱保存，而后一起檢測。

2.熒光定量PCR體系的配制（本步驟所有操作建議使用濾芯吸頭，以避免試劑被污染）
　　將探針法溶液1P、陽性支原體DNA、去離子水從-20 ℃冰箱中取出，放室溫融化（也可以用手握住幫助融化）。探針法溶液1P和探針法溶液2T開蓋之前，請高速離心一下（5000 rpm，離心1 min）。探針法溶液2T不能在室溫長久放置，建議在-20 ℃冰箱直接吸取。
　　如果樣品總數為N（N=待測樣品數+1個陽性對照+1個陰性對照），qPCR反應體系分為樣品經DNA提取和不經DNA提取兩個不同反應體系，具體如下：
2.1 樣品進行DNA提取后的反應體系（在DNA提取過程中，必須按說明書加入內參質粒mycoIC2）：
（1）反應體系：
表1. 樣品經DNA提取后的反應體系

【注】：總體積中多配制10%，為了防止移液誤差；裝有陽性支原體DNA的螺口管請不要高速離心，開蓋之前，只要用手指捏住，用力甩一下即可。吸取之前，請吹吸均勻后再吸取。如果不小心高速離心了，務必吹吸均勻后再吸取，否則陽性對照結果可能異常。
【例】：如果待測樣品為8個（加上1個陰性和1個陽性對照），則樣品總數為10個。探針法溶液1P的總體積為11×10×1.1=121 μL，探針法溶液2T的總體積為1×10×1.1=11 μL。
（2）將上述2種溶液混合，吹打均勻后，按每管12  μL分裝到熒光定量PCR八聯管中。
（3）待測樣品管加入18 μL提取好的待測樣品DNA（樣品DNA加入量不能減少，否則內參質粒擴增可能失?。?；陰性對照管加入2 μL內參質粒mycoIC2（吹吸均勻后加入）和16 μL去離子水（為防止去離子水被污染，此處建議使用20 μL移液槍配合200 μL吸頭進行吸取操作）；陽性對照管加入2 μL陽性支原體DNA 和16 μL去離子水。每管反應液的總體積為30 μL。
2.2 樣品不經DNA提取的反應體系：


（1）反應體系：
表2. 樣品不經DNA提取的反應體系

【注】：總體積中多配制6%，為了防止移液誤差，以保證每個反應管中的反應液足量；裝有陽性支原體DNA的螺口管請不要高速離心，開蓋之前，只要用手指捏住，用力甩一下即可。吸取之前，請吹吸均勻后再吸取。如果不小心高速離心了，務必吹吸均勻后再吸取，否則陽性對照結果可能異常。
【例】：如果待測樣品為8個（加上1個陰性和1個陽性對照），則樣品總數為10個。去離子水的總體積為16×10×1.06=169.6 μL 探針法溶液1P的總體積為11×10×1.06=116.6 μL，探針法溶液2T的總體積為1×10×1.06=10.6 μL。
（2）將上述3種溶液混合，吹打均勻后，按每管28 μL分裝到熒光定量PCR八聯管中。
（3） 待測樣品管加入2 μL未提取的待測樣品DNA，陰性對照管加入2 μL內參質粒mycoIC2（吹吸均勻后加入），陽性對照管加入2 μL陽性支原體DNA。每管反應液的總體積為30 μL。
2.3 蓋上熒光定量PCR八聯管蓋子，去除反應管中的大氣泡，3000-6000 rpm離心30 sec。

3.實時熒光定量PCR擴增
　　將PCR八聯管放入熒光定量PCR儀內，設置如下實時熒光定量PCR擴增程序：
表3. 熒光定量PCR擴增程序

【注】：支原體檢測熒光通道選擇FAM（Reporter: FAM，Quencher: None）；內參對照檢測熒光通道選擇VIC（Reporter: VIC, Quencher: None）；反應體積（Sample Volume）為30 μL；參考熒光（Passive Reference，只有ABI儀器需要設置）選擇None。

4.結果分析
4.1 ABI StepOne Plus 熒光定量PCR儀基線和閾值設定方法（其他熒光定量PCR儀的設置大同小異，請參考各自儀器說明書進行設置）：
（1）基線（Baseline）的設定：可以將Auto baseline前面的√ 去掉，然后手動設置基線的起點為2（將剛開始熒光值不穩定的幾個循環排除在基線之外。如果起點2不合適，可以適當增減），終點為10左右。
（2）閾值（Threshold）線的設定：不同通道的閾值應該分別設定。設定某個通道閾值線時，首先選中含陰性對照的若干個樣品，去掉儀器勾選的自動Threshold線，將其選項“√ Auto"改為“  Auto"，然后手動調整閾值線，以閾值線剛好超過正常陰性對照FAM通道擴增曲線（無規則噪音線）的最高點為準。
4.2 實驗有效性判斷：
　　陽性對照管：其FAM通道有典型的S型擴增曲線（即指數擴增），其VIC通道的擴增線呈直線或者S型曲線。
　　陰性對照管：其FAM通道的擴增線呈直線，其VIC通道應該有典型的S型擴增曲線。
　　如果陽性對照管、陰性對照管同時滿足上述條件，則說明本次實驗結果有效，否則實驗結果無效。
　　典型的陰性直線型擴增線和陽性S型擴增曲線如圖1所示：

圖1. 典型的陰性直線型擴增線（左）和陽性S型擴增曲線（右）

4.3 待測樣品結果判斷：
　　待測樣品有可能出現以下4種組合：
表4. 待測樣品管FAM通道和VIC通道可能組合

　　待測樣品管只要FAM通道有S型擴增曲線（組合1和組合2）就說明有支原體污染。因為外加的內參質粒mycoIC2分子數極少，如果支原體含量很大時，內參質粒的擴增會被*抑制，導致內參VIC通道無信號（組合2）。
　　如果待測樣品管FAM通道呈直線，而VIC通道有S型曲線（樣品的DNA提取過程和PCR擴增過程均正常。由于提取過程中，外加的內參質粒mycoIC2分子數極少，作為內參對照的VIC通道的Ct值會比較大），說明樣品無支原體。
如果陽性對照管和陰性對照管結果正常，而待測樣品管FAM通道和VIC通道均呈直線，說明PCR被抑制。如果樣品是經過提取的，最可能原因是：DNA洗脫前，吸附膜中的乙醇沒有揮發*（解決方法：洗脫前，將吸附柱放50-65℃烘箱至少15 min）。如果樣品是沒有經過提取的，則樣品本身含有抑制PCR的成分（解決方法：將樣品進行DNA提取或者離心清洗）。此外，二者相同的可能原因有（此種情況發生概率很低，一般不需要考慮）：內參質粒mycoIC2在運輸和儲存中有部分降解，導致回收或者加入的內參質粒mycoIC2分子偏少，導致內參VIC通道擴增失?。ń鉀Q方法：將內參質粒mycoIC2的加入量增加到原來的2-4倍）。
【注】：陽性結果需要結合擴增曲線（主要）和Ct值（次要）進行判斷，不能只看Ct值（因熒光值的波動，個別陰性樣品雖然擴增曲線基本呈直線，但可能會出現Ct值，此類樣品不能判斷為陽性。反之亦然：有些樣品有S型曲線，但是因為熒光值波動，導致沒有Ct值，此類樣品不能判斷為陰性）。
注意事項

1. 本產品主要用于細胞上清支原體污染檢測，僅限于科學實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領域

2. 防DNA污染注意事項：

（1）強烈建議所有操作（特別是qPCR體系配制步驟和吸取試劑盒中試劑的時候）使用濾芯吸頭進行操作，以免試劑被污染。
（2）必須確保使用的移液槍本身沒有殘留的支原體。
（3）樣品前處理的各類吸頭、離心管，以及吸取陽性對照DNA、待測樣品DNA的吸頭，務必小心處理，請將其裝入含有半瓶水的帶蓋的、可密封的瓶子內，全部樣品吸取完后，蓋上瓶蓋，以防止陽性DNA的揮發，造成環境的污染，進而造成假陽性。整個操作過程，最好不要說話，因為人的口腔和唾液都是帶支原體的。
（4）反應后，請勿打開反應管的蓋子，否則有可能造成檢測環境的污染。結果判斷完后，將其用自封袋密閉后，進行適當處理。

3. 實驗室必須嚴格分房間操作（本試劑盒建議在有窗戶、通風良好的普通房間內操作，請勿在密閉的房間操作。請勿在細胞培養間進行該步驟的操作，因為細胞培養間支原體污染概率很高）：

　　試劑配制房間1：專門進行定量PCR體系的配制（建議該房間全部使用進口濾芯吸頭。）
DNA提取房間2：專門進行支原體DNA的提??；
DNA加樣房間3：專門進行定量PCR體系配制后，添加待測樣品、陽性對照、陰性對照等操作；
PCR擴增房間4：進行實時熒光PCR擴增檢測。
【注】：如果房間緊張，可以考慮將房間2、房間3合并在一個房間，而房間1和房間4必須獨立。各房間物品（包括移液槍）均為專用，不得交叉使用。
如果出現qPCR的擴增被細胞的代謝產物抑制時（qPCR結果：支原體通道和內參對照通道均無擴增曲線），可以采取以下幾種措施：
（1）將取樣的時間提前到換液后2 d或3 d，此時細胞上清的PCR擴增抑制物相對比較少，一般不會產生嚴重的抑制。據我們測試，換液后5 d，PCR擴增抑制物就已經大量積累。
（2）用PBS對待測樣品進行離心清洗，去除樣品中的抑制物。具體方法如下：取1 mL細胞上清，先13000 rpm離心5 min，吸走950 μL上清；加PBS 950 μL，再次離心，吸走950 μL上清；再加PBS 950 μL，第三次離心，吸走全部上清，用50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8 重懸沉淀，95 ℃加熱處理5 min，簡單離心（1000 g，5 s）后，取上清進行檢測。但是該方法有如下缺點：第一，如果樣品支原體含量較少，離心清洗可能導致漏檢，因為離心清洗過程中，可能導致支原體部分丟失。第二，個別樣品，即使經過上述清洗也無法*去除抑制劑。
（3）抽提細胞上清的支原體DNA后再進行PCR鑒定。
（4）使用李記生物的《Quick Cell支原體快速檢測試劑盒(細胞培養專用)》（貨號：AC16L061）或者《Quick Cell 發光法支原體檢測試劑盒》（貨號：AC16L062）進行檢測，經測試，未發現這兩種試劑盒會被細胞的代謝產物所抑制。為了預防PCR的擴增被細胞的代謝產物抑制的問題，也可以考慮將所有待測樣品全部進行離心清洗或者DNA提取后，再使用本試劑盒進行檢測。

4. 支原體檢測樣品可以分成兩類：第一類，用含血清的培養液培養的哺乳動物細胞上清液，由于該條件非常適合支原體生長，培養數天后，支原體密度一般較高，可達107-9/mL，可以直接檢測。第二類，低溫保存的血漿、血清、臍帶血、胰酶、抗生素、未使用的培養液等樣品，由于這些樣品即使有支原體污染，支原體含量一般很少，直接使用快速支原體檢測試劑盒進行檢測，往往檢測不出來。這些樣品建議：（1）對樣品的支原體進行離心濃縮將支原體DNA濃縮提取，該兩種方法大約可以將檢測靈敏度繼續提高10-100倍。該方法速度快，當天出結果，但是可靠性不如后面的培養法。（2）使用支原體液體培養基（必須同時接種不含精氨酸和含精氨酸的兩種支原體液體培養基）培養3-7 d后，再進行檢測。具體方法請參考李記生物《Quick Cell 發光法支原體檢測試劑盒》（貨號：AC16L062）說明書中最后的注意事項部分。該方法速度較慢，需要3-7 d，但是可靠性高。

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