外泌體提取試劑盒（細胞上清）

產品描述
　　外泌體（exosome）是由細胞特異性分泌的包含RNA和蛋白質的小囊泡（30-150 nm），在血液、唾液、尿液及乳汁等體液中大量存在。外泌體被認為具有細胞間信使的功能，參與細胞間的通訊。然而關于它的分泌和攝取及其組成、“運載物"及相應功能的準確分子機制目前尚不明晰。
　　外泌體的生物學功能研究中需要分離完整的外泌體顆粒，而傳統超速離心方法步驟繁瑣、硬件要求高、操作難度大。李記生物自主開發的外泌體快速提取試劑盒，經過優化處理，適用于細胞培養上清液（尿液等）中的外泌體提取，并搭配純化過濾裝置，可快速高效地獲得高純度外泌體顆粒, 可用于電鏡分析、NTA粒徑分析、核酸分析、蛋白分析、細胞學實驗和動物實驗等。
訂購信息

產品組成

儲存條件
　　本品在室溫可穩定保存24個月，使用前請充分混勻。
自備材料
1. 高速離心機（可以達到10000 g離心力），渦旋振蕩器；50 mL或15 mL離心轉子， 2 mL離心轉子；50 mL或15 mL離心管，1.5 mL離心管；
2. 1×PBS緩沖液；
操作規程
一、樣品預處理
1. 取樣：如果是凍存樣品，從冰箱取出后于25℃水浴中進行解凍，將*融化后的樣品置于冰上；如果是新鮮樣品，收集樣品后置于冰上。
2. 樣品初始用量：對于細胞上清樣品，單次提取時的樣品量至少為20 mL。
3. 離心去除細胞碎片：將樣品轉移至離心管中，4℃，3000×g離心10 min，取上清轉移到新離心管中。
二、提取外泌體
1. 上清液預處理：在去除雜質的離心上清液中加入外泌體濃縮試劑（ECS），加入ECS的量與細胞上清液的體積比為1: 4.即若細胞上清液液體積是20 mL,則ESC的量為5 mL。
2. 溶液混合：加入ECS試劑后將離心管蓋緊，通過渦旋振蕩器混勻1 min，再放置于2℃至8℃靜置2 h。
3. 沉淀外泌體：取出裝有混合液的離心管，4℃以10000×g離心60 min，棄上清，沉淀中富含外泌體顆粒。【注】：盡可能吸凈上清液。
4. 外泌體重懸：取100 μL 1×PBS均勻吹打離心沉淀物，待其均勻懸浮在PBS中后，將重懸液轉移至新的1.5 mL離心管中。
5. 收獲外泌體顆粒：將含有重懸液的1.5 mL離心管，4℃以12000×g離心2 min，保留上清液，該上清液中富含外泌體顆粒。
三、純化外泌體
1. 純化外泌體：將收獲的外泌體顆粒粗品轉入外泌體純化濾器（EPF）上室中，4℃，3000×g離心10 min，離心后收集EPF柱管底的液體，此液體即為純化后的外泌體顆粒。
2. 外泌體的保存：純化后的外泌體以保存于-80℃低溫冰箱中，以備后繼實驗使用。
注意事項
1. 對于待測樣品粘度過大時，可將樣本用4℃預冷的1×PBS緩沖液進行等體積稀釋處理。
2. 當血清樣品收獲的外泌體濃度較高，收獲的外泌體顆粒無法通過EPF柱純化時，可用4℃預冷的1×PBS進行稀釋后再通過EPF柱離心。
3. 針對外泌體標志蛋白（CD 63, CD 9, CD 81等）進行Western blot檢測，可以鑒定所提的外泌體
4. 多數情況下，細胞在體外培養需要血清，但血清中含有外泌體，為了去除血清的外泌體，可以通過100000×g超速離心過夜，去除血清外泌體或者可選擇無血清培養基進行培養。
5. 在收獲細胞時，應確定死亡細胞占所有細胞5%以下。細胞死亡過程中會釋放大量大小不等的囊泡，細胞終會裂成碎片，它們在外泌體的純化過程中會污染活細胞產生的外泌體，影響外泌體的提取。
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